CRISPR Genetik Düzenleme Konsepti

İki yeni yöntem, aynı anda birden fazla hücre tipindeki genlerin CRISPR düzenlemesine izin veriyor.

Bugüne kadar, CRISPR enzimleri aynı anda bir hücre türünün genomlarını düzenlemek için kullanıldı: Örneğin bir doku veya organ içindeki belirli bir hücre türüne veya bir tür mikrop üremesine genleri keser, siler veya eklerler. bir test tüpünde.

Şimdi Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley, yaklaşık 10 yıl önce CRISPR-Cas9 genom düzenleme teknolojisini icat eden grup, aynı anda birçok farklı türden oluşan bir topluluk içinde gen eklemenin veya değiştirmenin bir yolunu bularak “topluluk düzenleme” olarak adlandırılabilecek şeye kapıyı açtı.

Bu teknoloji hala laboratuvar ortamlarında özel olarak uygulanıyor olsa da, yüzlerce veya binlerce farklı mikropun bir araya geldiği bir bitkinin bağırsakları veya kökleri gibi doğal bir topluluktaki düzenlenmiş mikropları hem düzenlemek hem de izlemek için kullanılabilir. Bilim adamları, mikrobiyal popülasyonları genetik olarak değiştirmekten bahsettikçe, bu tür bir izleme gerekli hale geliyor: örneğin, sindirim problemlerini düzeltmek için bağırsaktaki mikroplara genler eklemek veya mahsullerin mikrobiyal ortamını zararlılara karşı daha dirençli hale getirmek için değiştirmek.

Gen eklemelerini izlemenin bir yolu olmadan – bu durumda bir barkod kullanarak – bu tür eklenen genler, mikroplar rutin olarak genleri kendi aralarında paylaştıklarından herhangi bir yere gidebilirler.

ET-Seq ve DART açıklaması

Bir mikrobiyal topluluğun birden fazla üyesindeki genleri başarılı bir şekilde düzenlemek için, UC Berkeley bilim adamları iki yeni yöntem geliştirmek zorunda kaldılar: En üstte, belirli mikropların düzenlenebilirliğini değerlendirmelerine izin veren Çevresel Dönüşüm Sıralaması (ET-Seq); ve DNA düzenleme hepsi bir arada RNA güdümlü CRISPR-Cas transpozazı (DART), bu da bir kılavuz RNA tarafından tanımlanan genomdaki bir konuma yüksek düzeyde spesifik hedeflenmiş DNA yerleştirilmesine izin verir. DART sistemi barkodludur ve ET-Seq ile uyumludur, böylece bilim adamları birlikte kullanıldığında, yerleştirme verimliliğini ve özgüllüğünü ekleyebilir, izleyebilir ve değerlendirebilir. Kredi bilgileri: Jill Banfield laboratuvarı, UC Berkeley

“Kırmak ve değiştirmek DNA UC Berkeley doktora sonrası araştırmacısı Benjamin Rubin, DNA’nın ne yaptığını anlamak için izole edilmiş mikroorganizmalar içinde gerekli olduğunu söyledi. “Bu çalışma, bu mikropların doğada nasıl yaşadığını ve işlediğini çok daha fazla temsil eden mikrobiyal topluluklara bu temel yaklaşımı getirmeye yardımcı oluyor.”

Pek çok hücre veya mikrop türünü aynı anda düzenleme yeteneği, mevcut endüstri ölçeğindeki sistemlerde faydalı olabilirken – örneğin, hücrelerin toplu olarak kültürlenmesi için biyoreaktörler, daha hızlı uygulama, yapının anlaşılmasında bir araç olarak olabilir. karmaşık bakteri, arke ve mantar toplulukları ve bu çeşitli popülasyonlar içindeki gen akışı.

Doktora sonrası arkadaşı Brady Cress, “Sonunda, bağırsak bakterilerinde hastalığa neden olan genleri ortadan kaldırabilir veya mikrobiyal ortaklarını tasarlayarak bitkileri daha verimli hale getirebiliriz” dedi. “Ama muhtemelen, bunu yapmadan önce, bu yaklaşım bize mikropların bir topluluk içinde nasıl işlediğini daha iyi anlamamızı sağlayacaktır.”

Rubin ve Cress – her ikisi de CRISPR-Cas9 mucidi Jennifer Doudna’nın laboratuvarında – ve Yenilikçi Genomik Enstitüsü’nde (IGI) proje bilimcisi olan Spencer Diamond, bugün (6 Aralık) ortaya çıkan tekniği açıklayan bir makalenin ilk yazarları. ) dergide Doğa Mikrobiyolojisi.

Sayımdan düzenlemeye

Diamond, topluluk dizilimi veya metagenomik alanına öncülük eden bir jeomikrobiyolog olan Jill Banfield’ın laboratuvarında çalışıyor: karmaşık bir mikrop topluluğundaki tüm DNA’yı dizileyen ve bu DNA’yı, bazıları büyük olasılıkla tüm bu organizmaların tam genomlarında bir araya getiren pompalı tüfek. Daha önce hiç görülmemiş ve birçoğunun bir laboratuvar kabında yetiştirilmesi imkansız.

Metagenomik dizileme, son 15 yılda son derece gelişmiştir. 2019 yılında Diamond, Kuzey Kaliforniya’daki bir otlak çayırından toplanan toprak örneklerinden yaklaşık 800 mikrobiyal türden 10.000 ayrı genomu bir araya getirdi.

Ancak bunu nüfus sayımı yapmaya benzetiyor: Hangi mikropların hangi oranlarda bulunduğu ve bu mikropların topluluk içinde hangi işlevleri yerine getirebileceği konusunda benzersiz bilgiler sağlıyor. Ve organizmalar arasındaki karmaşık etkileşimleri ve nitrojeni sabitlemek gibi önemli ekosistem faydaları elde etmek için birlikte nasıl çalışabileceklerini anlamanıza olanak tanır. Ancak bu gözlemler yalnızca hipotezlerdir; Diamond, bu işlevleri ve etkileşimleri topluluk düzeyinde gerçekten test etmek için yeni yöntemlere ihtiyaç olduğunu söyledi.

“Metabolik geçişler fikri var – hiçbir mikrop çok büyük bir metabolik işlevler dizisi gerçekleştirmiyor, ancak çoğunlukla, her bir bireysel organizma bir sürecin tek bir adımını yapıyor ve bir miktar aktarım olması gerekiyor. organizmalar arasındaki metabolitler” dedi. “Bu hipotez, ama bunu gerçekte nasıl kanıtlayacağız? Artık sadece kuşları izlemekle kalmayıp, aslında birkaç manipülasyon yapıp neler olduğunu görebileceğimiz bir noktaya nasıl geliriz? Bu, topluluk düzenlemesinin doğuşuydu. ”

Araştırma ekibine UC Berkeley yer ve gezegen bilimi ve çevre bilimi, politika ve yönetim profesörü Banfield ve UC Berkeley moleküler ve hücre biyolojisi ve kimya profesörü Jennifer Doudna, Howard Hughes Tıp Enstitüsü araştırmacısı ve eş-kazanan önderlik etti. CRISPR-Cas9 genom düzenleme buluşu için 2020 Nobel Kimya Ödülü’nün sahibi.

Ekip önce bir topluluktaki hangi mikropların gen düzenlemeye gerçekten duyarlı olduğunu belirlemek için bir yaklaşım geliştirdi. Rubin ve Diamond’ın geliştirdiği, ET-seq (çevresel dönüşüm dizilimi) adı verilen tarama tekniği, bir prob olarak, birçok mikrobiyal genoma rastgele bir şekilde eklenen bir transpozon veya atlama geni kullanır. Transpozonu yerleştirmeden önce ve sonra topluluk DNA’sını sıralayarak, hangi mikrop türlerinin transpozon genini dahil edebildiğini tam olarak belirleyebildiler. Yaklaşım, Lawrence Berkeley Ulusal Laboratuvarı’nda ortak yazar Adam Deutschbauer tarafından geliştirilen tekniklere dayanıyordu. Dokuz farklı mikroptan oluşan bir topluluk içeren bir deneyde, farklı dönüşüm yöntemleri kullanarak aynı transpozonu beşine başarıyla yerleştirdiler.

Cress daha sonra DNA-editing All-in-one adlı hedefe yönelik bir dağıtım sistemi geliştirdi. RNACRISPR-Cas9’a benzer bir CRISPR-Cas enzimini kullanan ve belirli bir DNA dizisini içine alan ve barkodlu bir transpozon yerleştiren kılavuzlu CRISPR Cas Transpozazı (DART).

DART tekniğini daha gerçekçi bir mikrobiyal toplulukla test etmek için, araştırmacılar bir bebekten dışkı örneği aldı ve çoğunlukla 14 farklı mikroorganizma türünden oluşan kararlı bir topluluk oluşturmak için kültürledi. Kişiyi düzenleyebildiler E. koli hastalıkla ilişkilendirilmiş genleri hedef alan bu topluluk içindeki suşlar.

Araştırmacılar, kapalı bir kutuda bir bitki ve onunla ilişkili mikrobiyomu gibi yapay, basit toplulukları anlamak için tekniği kullanmayı umuyorlar. Daha sonra bu kapalı sistem içindeki topluluk genlerini manipüle edebilir ve barkodlu mikropları üzerindeki etkisini takip edebilirler. Bu deneyler, Enerji Bakanlığı tarafından finanse edilen m-CAFE adlı 10 yıllık bir programın bir yönüdür.s, Basit bir çim mikrobiyomunun dış değişikliklere tepkisini anlamaya çalışan Topraklarda Mikrobiyal Topluluk Analizi ve İşlevsel Değerlendirme için. Banfield, Doudna ve Deutschbauer, m-CAFEs projesinin bir parçasıdır.

Referans: Benjamin E. Rubin, Spencer Diamond, Brady F. Cress, Alexander Crits-Christoph, Yue Clare Lou, Adair L. Borges, Haridha Shivram, Christine He, “Karmaşık bakteri topluluklarında türlere ve bölgeye özgü genom düzenleme” Michael Xu, Zeyi Zhou, Sara J. Smith, Rachel Rovinsky, Dylan CJ Smock, Kimberly Tang, Trenton K. Owens, Netravathi Krishnappa, Rohan Sachdeva, Rodolphe Barrangou, Adam M. Deutschbauer, Jillian F. Banfield ve Jennifer A. Doudna, 6 Aralık 2021, Doğa Mikrobiyolojisi.
DOI: 10.1038/s41564-021-01014-7

Araştırma, m-CAFE’ler (DE-AC02-05CH11231) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (F32GM134694, F32GM131654) tarafından desteklenmiştir.

Gazetenin diğer yazarları arasında Alexander Crits-Christoph, Yue Clare Lou, Adair Borges, Haridha Shivram, Christine He, Michael Xu, Zeyi Zhou, Sara Smith, Rachel Rovinsky, Dylan Smock, Kimberly Tang, Netravathi Krishnappa ve Rohan Sachdeva yer alıyor. Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley; Berkeley Lab’den Trenton Owens; ve Rodolphe Barrangou Kuzey Karolina Eyalet Üniversitesi.





#Topluluk #Genetik #Düzenleme #Aynı #Anda #Çoklu #Hücre #Tiplerinde #Genleri #Değiştirmek #için #CRISPR #Kullanma